诱导多能干细胞(iPSC)在疾病中的作用

2020-12-05 15:44:31 782

诱导多能干细胞(iPSC)的获得已经彻底改变了干细胞研究(本文使用的缩略语表请参见下文中的表格)。像胚胎干细胞(ESC)一样,iPSC可无限增殖,并且基本上可分化成任何特定的细胞类型。与ESC不同,iPSC是从体细胞产生的,避免了伦理争议,为发病机制和药物筛选研究提供了患者来源的疾病模型,也为实验性移植疗法提供了细胞来源。一般而言,产生iPSC的方法是在容易获得、完全分化的细胞(例如血液、皮肤或尿液中的细胞)中使四种转录因子瞬时超表达(图1)。由此产生的细胞证明了细胞命运的可塑性1,2、重新表达了端粒酶并且恢复了端粒长度和“重置”了表观遗传景观,这些特征与永生化细胞系相关3

 

缩略语表 

 

图1. 干细胞的类型

具有自我更新和特定组织修复能力的组织特异性“成体”干细胞驻留在某些组织中,例如表皮、角膜缘组织、骨骼肌和血液。多能干细胞(PSC)包括来源于胚泡的胚胎干细胞(ESC)和人诱导多能干细胞(iPSC),产生iPSC的方法是在培养物内,在容易获得的细胞(例如血液、皮肤或尿液中的细胞)中使四种转录因子超表达,从而使这些细胞永生。患者特异性人iPSC可在体外广泛增殖并分化成不同的细胞,例如心肌细胞或神经元,以便在培养物中建立疾病模型、筛选药物、在疾病的临床前小鼠研究中检验功能,并终应用于临床。我们也可通过候选药物刺激内源性组织特异性干细胞的扩增和功能,以增强组织再生。

 

迄今为止,在成体组织干细胞的再生潜力方面,我们所取得的进展已经超过了多能干细胞(PSC)的进展。在某些情况下,这些细胞(以下称为成体干细胞,也称为组织特异性干细胞)相对有限的潜能使其可能在细胞疗法方面具有超过ESC和iPSC的优势:我们较少担心这些细胞的致瘤性,并且这些细胞与ESC或iPSC来源的细胞类型相比,更有可能获得成体细胞典型的基因表达模式。递送“成体”干细胞的一种替代策略是发现靶向组织驻留原位成体干细胞的药物,以增强其再生功能。我们在本文中介绍了干细胞疗法开发中取得的进展和面临的挑战,重点是皮肤、心脏、眼睛、骨骼肌、神经组织、胰腺和血液。

皮肤


大疱性表皮松解症(表现为皮肤和黏膜的慢性糜烂和溃疡)是一种严重的遗传性水疱疾病,在尝试修复患者皮肤的过程中,我们对皮肤再生有了进一步的理解(图2)。大疱性表皮松解症是由胶原和层粘连蛋白的编码基因突变引起,而胶原和层粘连蛋白是对维持皮肤结构完整性至关重要的细胞外基质的组成部分4

 

图2. 靶向皮肤和心肌

从突变LAMB3(编码层粘连蛋白组分[层粘连蛋白-332])引起交界型大疱性表皮松解症的7岁儿童表皮无水疱区域鉴定、分离和培养一组自我更新的角质细胞干细胞(全克隆),然后用携带“置换”LAMB3的逆转录病毒转导这些细胞(图A)5。将转基因表皮移植回患者,其皮肤的完整性显著改善。研究者在猕猴中开展了一项小型非随机研究17,将分化成心肌细胞的人ESC注射到梗死区及其周围。在接受干细胞疗法的猕猴中,注射后4周观察到左心室射血分数(LVEF)增加,但也检测到心律失常。

 

De Luca及其同事报告,给一名患大疱性表皮松解症的7岁男童植入转基因干细胞后,产生了80%的皮肤5。方法是从未受累皮肤采集2 cm×2 cm活检标本,对从该标本获得的自体组织特异性干细胞进行基因工程改造,从而表达正常层粘连蛋白。男童治疗成功是因为研究者发现了一组可在培养物中长期培养,且不丧失干细胞特性的自我更新“成体”表皮角质细胞干细胞(全克隆,holoclone)。其他研究者已经产生并移植了与前者类似,但表达胶原蛋白7a的较小的皮肤移植物,旨在利用美国食品药品管理局批准的培养材料治疗另一种大疱性表皮松解症亚型6

尽管骨髓、脐带血、间充质干细胞(MSC)和iPSC来源的角质形成细胞用于移植已有报道7,8,但自体表皮组织特异性干细胞移植仍是基准5,6,其优势是为长期治疗甚至治愈疾病提供了可能无限的非致瘤性细胞来源。我们需要在层再生方面取得类似进展,以改进烧伤患者的治疗。

 

心脏


心肌丧失(常见的原因是心肌梗死)可危及生命,因为心肌的再生能力极其有限。有人断言心脏含有专门的干细胞,可广泛替代丧失的心肌细胞,这一观点受到了质疑9,并且受到小鼠细胞谱系追踪研究的驳斥10。尽管人类碳标记(由于无意中暴露于原子弹试验产生的沉降物)揭示出成人心脏中确实存在心肌细胞更新11,但这一过程缓慢(每年不超过1%)12,与新生小鼠和斑马鱼心脏内的心肌细胞更新构成了鲜明对比13,14。然而,由于器官移植仍然是终末期疾病的治疗方案,因此各种细胞替代策略已被视为潜在的替代方案(图2)。目前已开展了近200项涉及干细胞的临床试验,常见的是递送来自骨髓的自体单核细胞和基质细胞。这些细胞也称为“成体”MSC,这个属于命名不当,因为它们不是来源于间充质,通常也不能再生成体组织(例如心脏组织)。几项大规模、随机、安慰剂对照试验取得的共识是,递送MSC虽然安全,但却不能产生长期的治疗益处9,11

与MSC形成鲜明对比的是,如果在啮齿类动物心肌梗死后短时间内将人ESC来源的心脏祖细胞和心肌细胞注射入其体内,上述细胞可植入并且使心肌再生15,16。在非人灵长类动物心肌梗死后将ESC来源的心肌细胞移植入其体内的研究产生了相互矛盾的结果:一项研究显示心肌修复,但伴有室性心律失常17,而另一项研究未显示心肌再生18。一项为期18个月的1期研究报告,将位于纤维蛋白补片(fibrin patch)内、ESC来源的心血管祖细胞移植到心力衰竭患者体内之后,这一操作安全且心肌收缩功能增强19

目前,我们面临的一个固有挑战是对于植入的工程化组织,应如何促进其电-机械功能整合,因此要使用同种异体ESC来源或自体iPSC来源的心血管祖细胞治疗心肌疾病,我们面临的难度似乎令人望而生畏。此外,ESC和iPSC来源的心肌细胞通常不成熟,植入情况差。为了克服这些挑战,研究者正在开发可指导心室、心房和起搏细胞分化方向的手段20,可增强植入细胞递送和保留能力的生物工程支架21,以及同时递送不同类型细胞的方法21,22

患者特异性iPSC的另一个用途是在体外建立疾病模型。尽管iPSC来源的心肌细胞相对不成熟,但它们表现出心肌病的一些特征,如心律失常、离子通道病、肥大、端粒过早缩短和扩张型心肌病22-24,并被用于研究发病机制和筛选药物。

 

眼睛


已有人提议将眼睛干细胞疗法用于治疗与视力丧失相关的疾病25。视网膜是位于眼睛内表面的光敏神经层,它依赖于下方视网膜色素上皮(RPE)的完整性。老年性黄斑变性的特征是RPE逐渐丧失,随后黄斑内光感受器死亡(图3),导致斑片状、波浪形的中央视觉,终失明。目前干性黄斑变性尚无治疗方法,该病涉及视网膜下的玻璃疣沉积和变性,上述情况发生于大约90%老年性黄斑变性患者。视网膜下RPE干细胞的递送和植入面临许多挑战,但在使用iPSC和ESC来源的RPE细胞的早期临床试验中,结果提示有必要进一步评估这一方法25,26

 

图3. 靶向视网膜、角膜和肌肉组织

在一项临床试验中,ESC被分化成视网膜色素上皮细胞(RPE),并以补片形式递送,用于治疗老年性黄斑变性(AMD)(图A)26。在涉及角膜的操作中,从患者健康眼的角膜缘组织获取自体组织特异性干细胞,在纤维蛋白基质(接触镜)上培养,用于移植,以替代因化学烧伤而受损的对侧眼的混浊角膜(图B)33。在治疗进行性假肥大性肌营养不良(图C)的临床试验中,含有“置换”基因的腺相关病毒载体(AAV)以全身性途径递送到患者体内。我们仍在等待试验结果(ClinicalTrials.gov注册号:NCT03368742、NCT03375164、NCT03362502)。目前正在动物模型中研究进行性假肥大性肌营养不良的另外一种治疗方法,具体操作是递送经基因修正的组织特异性卫星细胞干细胞或者iPSC或ESC来源的肌肉干细胞(MuSC),这将补充干细胞库并恢复肌纤维内肌养蛋白的表达。EMA表示欧洲药品管理局。

 

研究者在老年性黄斑变性的早期(即光感受器完全丧失之前)将新的RPE移植到动物黄斑内,结果功能失调的RPE被替代,动物的视力恢复27。在老年性黄斑变性的后期,细胞疗法除移植RPE细胞之外,还需要移植感光细胞(或可分化成感光细胞的细胞)。

在早期老年性黄斑变性的治疗中,ESC和PSC的无限增殖能力使它们成为有吸引力的RPE细胞来源。PSC来源的RPE在动物视网膜变性研究中恢复了动物视力,并且已在美国、中国、以色列、英国、韩国和日本进行了1期临床试验25,26。PSC来源的RPE细胞以细胞悬液的形式递送,或者接种在生物工程支架上,然后通过外科手术植入,以实现定位26。ESC-RPE细胞悬液移植与长期黄斑色素沉着相关,并且在某些情况下与视力改善相关,尽管改善程度有限24,28。然而,有一项患者特异性自体iPSC来源的RPE治疗老年性黄斑变性的试验被终止,原因是培养的iPSC在扩增过程中发生潜在致癌突变29-31

移植同种异体RPE细胞有引发免疫应答的风险。眼睛的一个优点是它与免疫系统相对隔离,但RPE是血液-视网膜屏障的一部分,在老年性黄斑变性中可能受损。因此,可能需要采取免疫抑制治疗,但只是暂时的,持续至RPE修复即可。用于眼部适应证的干细胞疗法属于局部疗法,易于靶向,且需要的细胞相对较少。除了RPE的修复,角膜和晶状体的修复也取得了进展(图3)25,32,33。2015年,一种能够在物理损伤或化学烧伤后修复角膜和恢复视力的“成体”组织特异性角膜缘干细胞制剂获得了欧洲药品管理局的上市许可。

 

骨骼肌


骨骼肌占体重的40%。随着年龄增长,肌肉量和肌肉力量进行性减少,因而限制活动能力。此外,遗传性肌肉消耗疾病会导致随意运动能力丧失、生活质量下降和过早死亡。细胞疗法是对抗衰老或疾病所致肌肉消耗的一种手段(图2)。常见和严重的遗传性肌肉疾病进行性假肥大性肌营养不良是由肌养蛋白编码基因DMD突变引起,肌养蛋白是肌肉收缩过程中对于膜完整性至关重要的结构蛋白34。1992年,一项临床试验检验了移植自体高增殖性人成肌祖细胞(称为成肌细胞)的疗效。受者的肌养蛋白表达有所恢复,但效率非常低,因为成肌细胞不能补充干细胞库,且植入效果差35。尽管成肌细胞缺乏疗效,但它们仍继续用于临床试验。

直到过去几年才有人描述了可识别并预先分离人“成体”肌肉干细胞(MuSC)的标志物;MuSC也称为卫星细胞,具有强大的再生潜力36-38。MuSC的干细胞龛与成熟多核肌纤维并列,MuSC被龛内的基底膜围绕,处于静止状态,但可受到启动而自我更新,并长期有效地修复损伤。然而,在细胞培养物中扩增MuSC是很困难的,原因是其干细胞潜能急剧丧失。采用富集培养基(具有与健康肌肉组织类似的弹性)39或水凝胶可减轻干细胞潜能的丧失40。然而,MuSC供应不足限制了它们的临床应用。尚未在临床上得到证实的另一种肌肉修复方法是在原位刺激组织驻留MuSC(图1),这样将无须进行细胞分离、扩增和递送41,42。这种修复方式已经在小鼠中建立了模型39

基因疗法和基因编辑正在临床试验中进行检验,目的是替代或恢复肌养蛋白(ClinicalTrials.gov注册号:NCT03368742、NCT03375164和NCT03362502)。随着腺相关病毒(AAV)载体的应用,动物研究表明,截短但有功能的肌养蛋白已经在骨骼肌中表达43,44。这些研究的一个局限性是引起免疫应答;采用AAV基因疗法载体重复给药的方式可能无效。克服这一问题的方法是诱导小鼠对肌养蛋白和AAV载体产生耐受45。另一个局限性是现有载体靶向的是成熟肌纤维,而非终生促进生长和再生的MuSC46

MuSC的另一种替代方案是以全身性途径递送周细胞亚群——中胚层成血管细胞(mesoangioblast)。在1期和2a期试验中,这些细胞几乎无副作用,但是对肌肉活检标本中的供者DNA进行的检测表明,仅存在低水平的供者中胚层成血管细胞,供者来源的肌养蛋白的表达水平低或无表达47。尽管如此,另一项预计很快会开始的临床试验将评估功能是否有所改善。

患者来源的iPSC在理论上可无限量供应自我更新的胚胎期治疗性成肌干细胞,从而可以在植入前进行基因置换或修正48-50。此外,因为骨骼肌相对而言不易发生肿瘤,因此它是PSC疗法的一个有吸引力的靶组织。

 

神经组织


大多数哺乳动物的脑部发育在子宫内已经基本完成。有限的神经发生可持续整个儿童期和成年期,但仅限于脑部特定区域,主要是海马齿状回和纹状体脑室下区。因此,破坏神经元的损伤或疾病会导致性残疾,因而促使人们关注作为细胞替代疗法来源的PSC。

这种疗法的前沿领域是帕金森病的多巴胺能神经元替代疗法,原因是几十年的经验表明,纹状体多巴胺能功能和运动功能有所改善,并且在一些患者中,胎儿来源的中脑腹侧组织移植物长期持续存在,这些移植物含有产生多巴胺的神经母细胞51,52。人们的一个担忧是尽管速度缓慢,但这种疾病可从宿主延伸到移植物,路易体(帕金森病的标志)的存在表明了这一点,因此提示其具有类似朊病毒的机制51,52。另外一个担忧是,接受胎儿组织移植的一些患者发生了运动障碍,如果我们采用一致性更高的细胞源,可能可以克服这一局限性,这样的细胞源例如PSC,因为我们可以选择具有生存能力、构成和效力的PSC(图4)。临床前研究表明,PSC来源的多巴胺能神经元(在特定中脑阶段且属于特定亚型)可在帕金森病的啮齿类动物和灵长类动物模型中发挥作用53-56。预计很快将开始以下临床试验:从组织相容性基因座属于纯合子的人产生iPSC来源的多巴胺能神经元,并且进行移植,从而能够与受者组织部分匹配57。预计不久的将来也将应用ESC来源的多巴胺能神经元开展试验58

 

图4. 靶向脑部,替代β细胞,生成血细胞

研究者已经将人iPSC来源的多巴胺能神经元祖细胞注射入食蟹猴(也称为长尾猕猴)壳核,用于治疗帕金森病54(图A)。细胞可存活,并且轴突延伸入宿主纹状体内。人胚胎干细胞来源的神经元祖细胞表现出类似行为55。培养的胚胎干细胞分化成对葡萄糖有反应,且分泌胰岛素的β细胞祖细胞,然后使用胶囊将其封装,防止免疫破坏(ClinicalTrials.gov注册号,NCT02239354)(图B)。研究者已经使用多能干细胞(iPSC和ESC)在体外条件下和小鼠体内产生多种血细胞(图C)。EMA表示欧洲药品管理局,NK表示自然杀伤细胞。

 

使用干细胞的其他神经系统适应证目前正在临床前研究阶段。棘手的难题之一是脊髓损伤。目前,移植各种形式的神经干细胞和少突胶质细胞祖细胞后已经产生了轴突生长和神经连接的效果,并提出了修复和康复的希望59,但尚未在严格的临床试验确立功能恢复的证据。

 

胰腺


1型胰岛素依赖型糖尿病的患病原因是分泌胰岛素的胰岛β细胞遭到自身免疫破坏(图3)。在长期2型糖尿病患者或者继发于损伤或切除术的糖尿病患者中,β细胞衰竭引起的胰岛素相对缺乏是β细胞替代疗法的另一个靶点。因为哺乳动物的自身胰腺不能从内源性组织特异性干细胞有效再生胰岛60,所以正在研究使用PSC替代胰岛。有数个研究组报告了在体外条件下和移植到动物体内之后,ESC分化成对葡萄糖有反应,且可分泌胰岛素的β细胞61-66。在很有前景的动物研究中,胶囊封装的细胞(encapsulated cell)在移植后发育成熟,成为分泌胰岛素的β细胞,在动物研究显示上述细胞的2年存活情况之后,研究者对ESC来源的内胚层祖细胞开展了一项1~2期试验(NCT02239354),目前该试验正在进行中67。我们目前尚不清楚以下哪种方案更好:单独使用β细胞祖细胞,或者混合使用β细胞祖细胞与胰岛A、B和E细胞祖细胞。

糖尿病患者每日多次监测自己的血糖水平,以调整胰岛素用药方案,但β细胞是一种天然的监测器,可能可以更和灵敏地控制血糖水平。1型糖尿病患者与许多其他疾病患者不同,他们由于自身免疫攻击的缘故,移植自体PSC来源的细胞将是不明智的。相反,我们需要可对抗免疫破坏和实现免疫耐受的策略。因此,阻断T细胞共刺激途径的方案具有良好前景65

因为胰岛素是一种循环激素,因此移植的细胞不需要在胰腺附近。目前的β细胞递送策略包括将胰腺内胚层祖细胞或成熟β细胞用胶囊封装(encapsulation)67,并且皮下放置胶囊,以便于监测和回收。通过胶囊封装可否防止免疫逃逸,避免损害移植物功能的炎症反应仍不得而知。

 

血液


红细胞、血小板、T细胞和造血干细胞属于人们探索多的PSC来源的细胞产品(图3)。尽管献血者慷慨地献出了供输血用的红细胞和血小板,但丙型肝炎病毒和寨卡病毒等病原体会污染血液,危及安全。众所周知,血小板半衰期短且需要室温储存,导致其易受细菌污染,因此维持充足的血小板供应极具困难。

红细胞和血小板的体外制造为我们提供了一个获得无病原体制品的途径,这些制品可以是特定剂量、特定抗原类型,这一途径很有吸引力。几个研究团队已经发现可以在体外条件下通过PSC大量制造红细胞。鉴于其胚胎起源,制造出的红细胞倾向于产生胚胎和胎儿型珠蛋白。它们在体外条件下大部分有核,但一旦移植到鼠宿主体内,细胞就会发育成熟68-70。为了对抗危及生命的出血,我们需要实现可预测的血小板供应,因此研究者侧重于利用可体外扩增、冷冻保存和分化成血小板的PSC,并通过其制造巨核细胞群71-73。如果要实现可扩大规模的巨核细胞供应,一个高效策略是将巨核细胞前体细胞进行可逆性永生化,方法是使驱动细胞增殖、阻止其分化的转基因发生受控的异位表达73。将转基因表达逆转之后,巨核细胞即可高效同步分化成血小板。

尽管仍有待临床证实,但理论上而言,PSC来源的红细胞和血小板的优势是相对安全;因为它们无细胞核,所以可以通过照射来降低致瘤风险。红细胞和血小板面临的一个障碍是,通过干细胞制造上述两种细胞的过程仍然效率低下且成本高昂。要在商业上可行,我们需要取得进展,包括改进生物反应器,并且进一步阐明促进巨核细胞分裂成血小板的生物力学原理74,75。在人体内对PSC来源的血小板进行的试验计划于今年开始。

靶向肿瘤的T细胞疗法取得了令人兴奋的结果,因为它们有可能在既往难治的淋巴样癌(lymphoid cancer)患者中诱导缓解76。然而,目前的方法要求患者接受白细胞单采术,分离自体T细胞,然后对其进行修饰(方法是异位表达靶向B细胞特异性CD19抗原的嵌合抗原受体[CAR]),之后将细胞体外扩增并回输到患者体内。这一烦琐的劳动密集型制造过程导致这一疗法的成本极其高昂。理论上而言,PSC来源的T细胞可以为CAR修饰提供取之不尽的同种异体供给。为了避免免疫应答,我们需要对其进行进一步的基因工程改造,利用CRISPR-Cas9(规律成簇间隔短回文重复与Cas9核酸内切酶组合)清除CAR T细胞中的主要组织相容性复合体分子。如果对PSC来源的肿瘤杀伤性CAR T细胞做出原理验证,将使我们有可能制造出“现成的”肿瘤靶向T细胞疗法,并且几乎一定会降低成本77,78

在通过基因工程从PSC制造血细胞谱系的工作中,获得可植入的造血干细胞是挑战。尽管拥有数百万供者的同种异体骨髓登记库不断增多,而且免疫抑制药物增强了对移植物抗宿主病的控制,但同种异体骨髓移植仍然是一种死亡风险高的手术,限制了其在恶性疾病或严重遗传病治疗中的应用。经过几十年的努力,一些研究团队报告,他们从小鼠、猴子和人类PSC成功制造出了多能淋巴-髓系造血干细胞和祖细胞69,70,79,80。PSC是一种很有吸引力的方法,它将基因修复和细胞替代疗法相结合,可治疗镰状细胞贫血等遗传性骨髓疾病,但细胞增殖过程中致癌突变增加的可能性仍然令人担忧。

 

未来展望


ESC和iPSC的获得燃起了我们对细胞替代疗法的期望,但其的作用是对组织分化机制和人类疾病病理生理学进行基础研究。通过患者来源的iPSC,研究者已经在体外条件下建立了数十种疾病的模型22-24,81,82,为了战胜疾病表型而进行的广泛筛选也产生了候选药物83,84

迄今只有相对很少的临床干预措施经过检验,而证明组织替代疗法的有效性仍然只是我们的愿望。ESC体外分化的一个局限性是细胞往往不成熟,尽管有时移植入体内后可发育成熟16,53,60,68,69,85,86。我们面临的其他挑战包括需要有效扩大细胞制造规模并进行质量控制,特别是考虑到我们担心长期培养的细胞发生致癌突变87。此外,我们还需要符合以下要求的递送方式:破坏性很小,同时实现对宿主组织的强力渗透、植入和功能整合。另一个挑战是如何选择有可能从治疗中获益的患者(表1)。

 

表1. 多能干细胞临床应用中面临的挑战