科学证明了:干细胞真实存在

2021-04-03 01:01:26 212

干细胞移植

要证明某个细胞是干细胞直接的方法就是进行细胞移植(transplantation):一种方法是将胚胎干细胞移植入胚泡中,与宿主的内细胞群混合参与胚胎的发育,分化出构成个体的所有细胞群5\这种将胚胎干细胞移植到原本就存在干细胞的胚胎中的移植称为原位(orthotopic)移植:另一种方法是将胚胎干细胞移植到肾脏的包膜下,形成畸胎瘤(teratoma),分化出三胚层所有的细胞群6.这种将干细胞移植到原本没有干细胞存在地方的移植称为异位(ectopic)移植。

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由某种组织纯化而来的干细胞,仅移植给一个个体,能产生干细胞和分化细胞,是能证明干细胞存在的证据,但是这种成功的例子也仅见于造血干细胞七其中的一个原因是,要从干细胞微环境中提取出用于移植的干细胞,在技术上是有难度的。同时,异位移植成功与否,受很多偶然因素影响。在运用一种移植方法无法证明其干细胞特性时,只能运用其他方法加以证明。

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生物体选择性地灭绝(abolishmenl或者depletion)某个特定种类细胞,同时机体组织没有定期地补充此类细胞,使该细胞的稳态(homeostasis)无法维持,发生细胞耗尽,这个被耗尽的细胞可以是干细胞:放射线照射(radiation)对于增殖细胞有较强的诱导细胞死亡效果,其中包括增殖中的干细胞:被放射线照射过的小鼠因为无法造血而导致死亡,就是因为造血干细胞的死亡。此时进行造血干细胞的移植可以恢复造血,就能使小鼠存活下来。维持涡虫高再生能力的多能性干细胞,对放射线高度敏感=涡虫经放射线照射失去再生能力后,检测其失去的特异性细胞种类,就可以确定多能干细胞的存在。

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但是,放射线照射杀死干细胞并无特异性,对于不增殖的、处于休眠状态的干细胞效果不明显。因此,近常用干细胞特异表达基因作为杀灭十细胞的指标:例如,核酸诱导体Acyclovir能被单纯疱疹病毒的胸昔激酶(HSV-tk)催化变成有细胞毒性的Acyclo-guanosine monophosphate(Acyclo-GMP)。小鼠胸腺激酶的活性是哺乳动物类的3000多倍,根据这个原理,人为地将Acyclovir整合到表达HSV-tk的细胞中,目的是杀死转基因小鼠的毛囊干细胞:通过加入表达特异性角蛋白1~15的启动子来表达HSV-tk,同时加入Acyclovir后,毛囊根部存在的毛囊干细胞可特异性地被杀死。用此方法可以阻止毛发根部的新陈代谢,但依旧维持了皮肤的新陈代谢。由此可以证明,表达这个角蛋白1~15的毛囊干细胞是参与毛发根部形成的主要因素丄同理,也可以人为地使细胞表达白喉毒素受体基因,再给予这个表达细胞白喉毒素就可能杀死这个细胞:肠道表达Lgr5基因的干细胞及其机能,就是通过这种方法证明出来的。

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干细胞标记

一般认为,成体干细胞有两种存在状态:一种是活跃地进行自我更新来维持干细胞的数量.一种是处于休眠状态并偶尔进行分裂:通过标记DNA合成的手法,可以做到不管在哪种状态下都能提示干细胞的存在:给小鼠注射一次漠脱氧尿喘陡核甘(BrdU),可以嵌入到全身正在复制的DNA链中。之后,就可以用抗BrdU抗体来检测出含有BrdU的DNA链:处于活跃期进行0我更新状态的干细胞很容易被BrdU标记,之后很容易被检测出来.然后,以细胞微环境特定的解剖学位置为起点,经过一段时间的解析,如果能确认含有BrdU标记的细胞从哪里开始分化成多种细胞的话,那么在这个特定的解剖学位置里所存在的增殖细胞,就可以推测为干细胞。另一方面,对于处于休眠状态且少有分裂的干细胞来说,对BrdU的摄取率虽然较低,但一旦摄取的话,继承了BrdU的子细胞将在很长时间内都能维持此状态。这种保留标记细胞(label retaining cell)也可以说是干细胞的候补。

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但是,这种DNA标记法对所有增殖中的细胞都有标记作用,对于干细胞并没有特异性:因此,近来较常用的方法是以干细胞特异性表达基因为目标的标记法—例如,P1噬菌体的Cre重组酶(Cre)能很有效地介导loxP位点间基因序列的重组同时,将Cre与变异型雌激素受体融合而成的人工基因CreER,会向人工激素诱导体Tamoxifen移行.发挥其重组酶的机能:只有重组发生时,这个人工基因和表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因才能组合在一起.根据此原理,可以详细地解析岀表达特定基因的干细胞在体内终会走向怎样的命运(图1.4):小鼠肠道上皮十细胞能特异性表达由Lgr5启动因子控制的CreER基因和由Rosa26启动因子控制的LSL-GFP基因=加入Tamoxi-fen后,在此时间点表达Lgr5的干细胞,选择性地进行重组酶活性的诱导,这些细胞在此之后就能持续性地表达GFP=因为这些表达GFP的细胞在经过细胞分裂后仍能维持GFP的表达,因此在加入Tamoxifen一段时间后,就能很容易地观察到这些细胞究竟分化成了哪些细胞:研究结果证明,Lgr5阳性细胞可以是肠道上皮所有种类的细胞,从而证实Lgr5阳性细胞来源于肠道干细胞。

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干细胞的培养

取出某种细胞放在体外进行培养,能分化成与原来的细胞不同的分化细胞时,我们就推测这种细胞具有分化能力。并且,如果能证明这种细胞在培养条件下能进行自我更新的话,就可以推测这种细胞为干细胞:在这里用“推测”这种说法是有原因的。用这种方法确定的干细胞,即使在体内的生理条件下,也不能保证其会以干细胞系统的形式存在。但是,从发育过程中提取出来的干细胞,也包括ES细胞,基本上也只能通过这个方法来确定其干细胞的性质。同时,也有必要考虑到,成体干细胞也只能是在同样的人工培养的条件下,才能确定其干细胞的性质。另外,在这种培养条件下,干细胞的性质并不是仅由细胞的来源决定的,培养条件对于干细胞性质的影响也不容忽视的。