造血干细胞研究的原理是什么?

2021-04-09 18:22:16 193

造血干细胞研究的开端

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造血干细胞是研究多的干细胞。在一个世纪之前就推测出,组织再生能力较强的骨髓中有干细胞的存在。另外,在广岛、长崎的核爆炸中,我们知道了骨髓造血组织对放射线有很高的敏感性:因为造血障碍引起的中性粒细胞减少导致的感染,以及血小板减少导致的出血,都能很快导致人的死亡。造血障碍程度与放射线暴露量成正比。

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但即使照射了致死剂量的放射线(人和小鼠都是10Gy左右),如果能进行骨髓移植,还有存活的可能。通过移植含有造血干细胞的骨髓细胞,不仅能缓解血细胞减少,还能长时间地维持造血功能。1957年,研究者发表了在小鼠模型上进行骨髓移植白血病的方法",利用放射线照射下杀死白血病细胞,再通过移植正常的造血干细胞来恢复正常造血;之后乂出现了多种实验动物的骨髓移植研究。随后,Thomas等研究者们进行了人体的临床试验,当时并未认识到组织适应性等问题,所以人体骨髓移植白血病等恶性疾病经过了一个曲折的过程。但是,在很多患者的协助与临床医师的努力下,造血干细胞成为人体干细胞用于再生医疗的先驱。

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造血干细胞的定义

造血干细胞是具有自我更新能力和多向分化能力的一种细胞:该细胞由发明了脾集落形成细胞定量法的Till和McCulloch明确记载,他们同时证明该细胞具有很强的增殖能力、人们过去都在关注造血干细胞的可塑性,后来渐渐地认识到其增殖能力的重要性:比如就造血干。

细胞而言,如果向心肌细胞或神经细胞转化只能生成几个细胞,真的能超越其细胞系谱或者胚层界限,产生血液以外的细胞吗?对此暂时还没有确切的答案。但是,如果其有较强的增殖能力,能产生不计其数的心肌细胞或者神经细胞的话,可能性还是存在的七但是目前认为,造血干细胞还不具有与其较强增殖能力相匹配的可塑性。

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向照射了致死剂量放射线的小鼠注射正常小鼠的骨髓或脾脏细胞后,在第8天到第12天后就可以在脾的表面形成肉眼可见的“瘤”,称之为“脾集落二一个脾集落是由一个脾集落形成细胞发育而来的。移植后第12天的脾集落中可以观察到中性粒细胞、吞噬细胞、有核红细胞、巨核细胞等多种血细胞(具有多分化能力):另外,在集落中还检测岀第二次移植后可以再次形成脾集落的细胞(具有自我更新能力儿Till和McCuUoch根据这些观察结果确立了造血干细胞的概念(两人也因此被称为“干细胞之父”):虽然现在已经明确了脾集落形成细胞不是所谓的造血干细胞,但正是脾集落形成细胞的发现促进了近代造血干细胞的研究。

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造血干细胞系统

造血干细胞系统是指以造血干细胞为顶点,以各种成熟血细胞为底边而形成的金字塔式,造血干细胞和成熟血细胞之间有各种各样的定向祖细胞。一个造血干细胞对应一个造血金字塔,这对于干细胞系统的形成是非常重要的:例如:一只造血系统已破坏的小鼠只需移植一个造血干细胞就可以使该小鼠的造血系统再生。而且再生的造血干细胞具有长期维持自我更新的能力,一个干细胞的移植与移植一个完整造血系统的效果是等同的。

成熟小鼠的骨髓中约有一万个造血干细胞存在:一部分造血干细胞出现异常,失去造血功能,对造血系统整体来说几乎没有影响。即使一部分的造血干细胞出现癌变,克隆增殖并且占据骨髓也需要一定的时间。实际上多数的细胞在克隆的同时会遗传变异,其中能对肿瘤免疫对增殖有利的克隆会被优先选择。

 

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造血干细胞系统是以造血干细胞为顶点,以成熟红细胞为底边的金字塔式的结构造血干细胞具有自我更新和多向分化的能力,使造血金字塔再生、修复和维持成为可能

造血干细胞分析

造血干细胞可以通过移植试验进行检测,其方法是观察经过与人体骨髓移植相同处置后的小鼠,测定小鼠的造血干细胞(图5.2):为了确保被检测细胞中即使没有造血千细胞和定向祖细胞,接受致死剂量放射线照射的小鼠仍能生存,通常使用可以评估造血干细胞质与量的竞争性造血系统重建分析法:这种方法初在1970年发表,如今在其基础上大幅度增加了敏感度和特异性,使造血干细胞的研究有了极大的发展为了尽量减少试验误差,用于提供竞争细胞的小鼠的性别和周龄必须一致竞争细胞中需含有一个以上的造血干细胞和多个具有辐射保护活性的定向祖细胞:辐射保护对于通过致死剂量放射线照射后的小鼠起到早期保护的效果未经过骨髓移植的小鼠在照射后10-14 H内几乎全部死亡这期间机体为了生存形成了以脾脏红系定向祖细胞为主的前体细胞,一般认为这些细胞具有辐射保护能力,虽然使用的竞争细胞越多。

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得到的数据可信度越高,但当试验细胞中含造血干细胞很少的时候,为了提高检出的敏感度需要使用数量的竞争细胞(一只小鼠使用2x10’个骨髓细胞)。

应用与人类骨髓移植几乎完全相同的方法处置小鼠,利用放射线照射造血功能已被破坏的小鼠,再将含有造血干细胞的试验细胞移植到小鼠体内,同时将竞争细胞也移植入小鼠体内以保证小鼠的生存,这样可以使造血干细胞的活性定量化,便于检测。

设计小鼠模型时,为了区别试验细胞、竞争细胞和受体小鼠源细胞,通常使用同种小鼠:这样可以排除用于标记的特定基因的多态性的干扰。移植试验通常使用Ly5.1同类小鼠。Ly5.1抗原是一种异体抗原,这种抗原所对应的抗体可以显示小鼠的制作过程。但是,在过去的经验中,使用致死剂量的放射线照射条件下这种抗原可能不应答:所以需要注意,未经放射线照射或者没有使用足够量的放射线是造成不应答的可能原因。

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造血干细胞的定向分化能力是移植的基础,但是由于不能在人身上进行试验性移植,所以Dick等人设计出在免疫缺陷的小鼠体内检测出人类再构筑细胞缺损的小鼠进行交配生成小鼠,这种小鼠可以高效地检测到含有人类T细胞的血液细胞:但是人的寿命可以到80多岁,而小鼠的寿命多不过两年。人类造血干细胞与小鼠造血干细胞相比,需要花费更长时间来完成造血系统的重建。且免疫缺陷的小鼠寿命很短,所以人类造血干细胞移植后需要的观察时间要比小鼠造血干细胞的观察时间更长。研究中需要注意,与小鼠造血干细胞不同,人类造血干细胞二次移植后成活率低下,只能检测出部分造血干细胞。

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